Workflow de clonage d'ADN

Trucs de PCR et trucs de clonage dMADN par Simon Roy, Ph.D

Cette page sera mise à jour plusieurs fois. Il vous serait utile de la consulter dans le futur afin d’obtenir des mises à jour sur mes protocoles. ”Bookmark”

La page sert aussi de lab book afin de partager mes techniques avec vous.

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Digestions d’ADN à préparer soigneusement

**Préparation pour le clonage d’ADN dans un plasmide de taille variant entre 3 et 15 kb*.**

* Il faut adapter soit la quantité de plasmide digéré au départ, soit la quantité ajoutée à l’assembly CU101 ou CU201 (ou le Gibson ou NEB HiFi. C’est qu’il faut prévoir le volume (ul) de la réaction d’assembly, et donc aussi la concentration de plasmide backbone digéré.

CU101 performe mieux que le NEB HiFi pour la correction des extrémités et le taux de clones positifs issus de la transformation bactérienne.

La préparation du plasmide ou du vecteur dans lequel on insère un fragment PCR

Une étape clef et primordiale.

Prenons un vecteur standard comme pcDNA3 de taille de 6kb.

1ère diggestion de 5 ug d’ADN plasmidique.

Volume 100ul

RE1 : 1 ul

RE2 : 1 ul

15 à 60 min à 37 C.

PCR purification APGCK300, FAGCK ou FAEPK

Éluer avec 44 ul de EB

2e digestion du plasmide

Volume final : 50 ul

RE1 : 0.5 ul

RE2 : 0.5 ul

15 à 60 min à 37 C.

Gel extraction APGCK300, FAGCK ou FAEPK et éluer avec 40-50 ul selon ce qu’on a sur gel. Utiliser FAEPK au besoin et éluer avec 12 ul EB réchauffé*.

* Pour les gros fragments > 7-8 kb, il peut être utile de réchauffer le EB ou d’incuber 2 minutes plutôt qu’une.

Ex:

Plasmide 3 kb : digérer 2-3 ug de plasmide initial est suffisant.

Plasmide de 10 kb ou plus : considérer en digérer jusqu’à 10 ug ou utiliser FAEPK.

Plus le fragment à extraire est gros, plus on en perd en gel extraction et ou plus il s’en brise.

Je vise à utliser entre 0.2 à 1 ul de plasmide dans ma réaction d’assembly CU101.

Ex:

H2O : rien

2x : 1 ul

Vecteur : 0.2 ul

insert(s) : 0.2 à 1.5 ul

Pour les inserts, utiliser mon Fast & Steep PCR et mon F&S Overlap Extension

Température d’extension du PCR?

Je ne fais l’extension PCR que très rarement à 72 °C, même avec la FastPfu FLY.

Je fais l’extension PCR à 68 degrés 95% du temps, spécialement lorsqu’il sagit d’amplifier une séquence d’ADN pour le cloner ou que l’ADN à amplifier par PCR est > 5 kb ou que la séquence est AT-rich.

AT-rich : 25-40% GC à extension à 65-68 °C (jusqu’à 62 °C avec la KD Plus seulement)

GC-rich: > 70% GC à extension à 72-75 °C (AP231, AP221 ou GoldPfu, mais pas avec KD Plus AP301).

Protocoles très COOL (je fais TOUT le temps ça et ça fonctionne 99% du temps) :

https://www.civicbio.com/project/fast-steep-pcr-protocol-dna-amplification/

https://www.civicbio.com/project/overlap-extension-pcr-protocol/

To get higher yields, some primers are used in excess as in asymmetric PCR.

Why perform Overlap Extension PCR?

At Civic Bioscience, we often use OE-PCR to fuse multiple DNA sequences together for the purpose of:

Cloning : a complete gene cannot be amplified from cDNA because specific sequence segments are too different in composition (i.e GC content) and are very difficult to amplify when the amount of target DNA is very low.
Site-Directed Mutagenesis : performing DNA mutagenesis using a 2-sided PCR overlap extension followed by ligation or seamless assembly into a linerized vector.
Multiple gene fusions, cassette or plasmid engineering : things can become quite complex when we engineer custom clones for our customers. Assembling 9 DNA fragments together by seamless assembly (i.e Gibson assembly) won’t work efficiently. But, if assembly by OE-PCR is used to put together fragments in groups of 3, then seamless DNA assembly using pEASY-Uni will become easy enough to get our clones rapidly. We use the Fast & Steep PCR protocol to accomplish this.